研究报告/Research Report
切除伤口愈合及紫雪花不同提取物的抗氧化活性 
Sujin Jebakumar K.T.1,2 
,
Balavigneswaran C.K.1 
,
Prakash S.1 ,
Natheer H.Y.2 ,
Srinivasakumar K.P.2
,
Balavigneswaran C.K.1 ,
Prakash S.1 ,
Natheer H.Y.2 ,
Srinivasakumar K.P.2
1 Department of Biotechnology, Udaya School of Engineering, K.K. District, Tamil Nadu, India
2 Inbiotics, Parvathipuram, Nagercoil-3, Kanyakumari District, Tamil Nadu, India
作者 通讯作者
植物药与药理学杂志, 2013 年, 第 2 卷, 第 11 篇 doi: 10.5376/jpmp.cn.2013.02.0011
收稿日期: 2013年01月08日 接受日期: 2013年01月15日 发表日期: 2013年01月23日
2 Inbiotics, Parvathipuram, Nagercoil-3, Kanyakumari District, Tamil Nadu, India
作者 通讯作者
植物药与药理学杂志, 2013 年, 第 2 卷, 第 11 篇 doi: 10.5376/jpmp.cn.2013.02.0011
收稿日期: 2013年01月08日 接受日期: 2013年01月15日 发表日期: 2013年01月23日
© 2013 BioPublisher 生命科学中文期刊出版平台
本文首次以英文发表在 《Medicinal Plant Research》(2013, Vol.3, No.3)上。现依据版权所有人授权的许可协议，采用 Creative Commons Attribution License 协议对其进行授权，用中文再次发表与传播。只要对原作有恰当的引用, 版权所有人允许并同意第三方无条件的使用与传播。如果读者对中文含义理解有歧义，
推荐引用：
引用格式(中文)：
Sujin Jebakumar等, 2012, 切除伤口愈合及紫雪花不同提取物的抗氧化活性, 植物药与药理学杂志(online) Vol.1 No.2 pp.1-8 (doi: 10.5376/jpmp.cn.2013.02.0011)
引用格式(英文)：
Sujin Jebakumar et al., 2012, Excision Wound Healing and Antioxidant Activity of Different Root Extract of Plumbago Indica, Zhiwuyao Yu Yaolixue Zazhi (online) Vol.1 No.2 pp.1-8 (doi: 10.5376/jpmp.cn.2013.02.0011)
摘要
本研究旨在用切除后创面模型探讨紫雪花根部提取物中乙醇，氯仿和己烷对伤口愈合的作用和其抗氧化活性。将被测试的动物分为五组，每组五个提取物，每个提取物中10% W / V制备了生理盐水和0.1%的丙二醇。不同根提取物的抗氧化活性研究包括过氧化氢、DPPH和体外超氧阴离子自由基的清除作用。紫雪花的乙醇提取物具有比氯仿和正己烷提取物更好的促进创面愈合的作用，并且它比商业伤口愈合剂Burnol在第九天完成伤口愈合实验更有效。这展现了快速上皮化，更好的伤口愈合和减少感染。正己烷提取物也有良好的伤口愈合能力，而氯仿提取物被认为是无效的伤口愈合剂。伤后愈合的生化分析表明，在用氯仿提取物处理的小鼠中，差分白细胞计数是高于正常计数，在未经处理的小鼠中它甚至更高。结果表明，乙醇提取物具有强大的抗氧化能力，正己烷提取物具有一定的抗氧化活性，氯仿提取物作为抗氧化剂是无效的。紫雪花的乙醇提取物具有良好的伤口愈合能力，相较于其他提取物也表现出良好的抗氧化性能。
关键词
紫雪花；切除；上皮化；DPPH；过氧化氢；超氧阴离子
紫雪花，一种双子叶亚纲植物，它的民族药用价值广为人知。紫雪花在治疗活性，根源，自然萘醌白花丹素方面拥有丰富的来源。Plumbagin已经被报道具有药性(Mathew et al., 2002)抗癌(Kuo et al., 2006)，强心(Itoigawai et al., 1991)，抗疟药(Likhitwitayawuid et al., 1998)，抗生素(Didry et al., 1994)和抗生育(Bhargava, 1984)活动。六种不同的白花丹物种之间，紫雪花是白花丹素最丰富的来源(Mallavadhani et al., 2002)。
伤口愈合过程包括几个步骤，包括凝血，炎症，肉芽组织形成，基质，结缔组织重塑，胶原化和伤口强度采集。据观察，芦荟增加肉芽组织胶原含量，以及通过增加醛含量和降低酸溶解度增加其交联度(Kaufman et al., 1988)。芦荟、纹鳢，也被认为对粘多糖的合成及有效调节伤口愈合有积极的影响(Chitra et al., 1998)。通过局部应用从积雪草中分离出的积雪草苷0.2%溶液，产生56%的胶原含量增加量和更好的上皮调和性(Shukla et al., 1999)，但姜黄水绝对延迟角膜浅层伤口的愈合和延迟角膜穿透伤的愈合也会明显降低角膜伤口的抗拉强度(Mehra et al., 1984)。
活性氧(ROS)，包括超氧自由基，羟基自由基，单线态氧和过氧化氢，通常生成生物反应或外生因素的副产物(Kikuzaki et al., 1993)。这些物种的一种有效的广谱清除剂，可能作为一种可能对自由基介导的细胞损伤和疾病的预防性干预(Ahmad et al., 1993)。最近的研究表明，许多植物产品包括多酚类化合物、萜类和各种植物提取物显露出一种抗氧化作用(CITS et al., 1991; Bang et al., 2001)。
我们目前一直在研究对紫雪花不同根提取物的愈合伤口能力及其抗氧化活性。
1结果
1.1伤口愈合活性
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表 1 P对紫雪花不同根提取物的植物化学成分筛选
注: Pi: 紫雪花; H: 正己烷; C: 氯仿提取物; E, W: 乙醇
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表 2 对紫雪花不同根提取物对伤口愈合的影响(提取物的浓度200克/毫升甘油)
注: a: 在P<0.001时治疗组与对照组比较; b: P<0.01,其值在S.D. (n=5)之间
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10% w/v的紫雪花的乙醇提取物局部应用增加创面收缩率，减少感染，加速上皮化和胶原化，在第九天完成伤口收缩。在局部治疗的小鼠肉芽阶段和重塑期可观察到快速生物综合活动。局部应用氯仿提取物10%的小鼠中可观察到缓慢的生物合成行为和其无休止性。在重塑阶段，通过产生氢键形成成熟的胶原蛋白和分子间的交叉链接的形成中，相比氯仿提取物，局部应用己烷提取物的小鼠显示出正常的伤口愈合活性和更好的抗感染性。感染引起的生物被认为是金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。菌落计数在未处理的伤口显示较高，在乙醇和Burnol治疗下的伤口菌落数很低。生化分析表明，小鼠的所有功能，伤口后处理均正常(表3)。白细胞计数显示，在正己烷提取物的感染更为重要。使用Burnol治疗，使伤口完整收缩，商业的伤口愈合剂可在第十天获得(P＜0.01与对照组相比)。
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表 3 创伤后处理小鼠模型的生化分析
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1.2清除DPPH自由基能力
当自由电子的抗氧化化合物接受捐赠，DPPH脱色可定量测定吸光度的变化。提取物的抗氧化活性数据表明(图1)，乙醇提取物比氯仿和正己烷提取物更具有清除活性。在最大浓度时自由基的清除活性为乙醇提取物>正己烷提取物>氯仿提取物。我们也观察到乙醇提取物的充分剂量依赖性和其他提取物的饱和浓度为0.2 mg/ml。
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图 1 I紫雪花不同根提取物对DPPH自由基的清除作用
注: 呈现的结果标准偏差(n=3)
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1.3清除超氧阴离子自由基
在三种提取物中，研究发现乙醇提取物对于体外核黄素-NBT-光系统中产生的超氧化物自由基是一种有效的清除剂。而其他提取物只表现出约20%的活跃性(图2)。从这个实验中利用紫雪花的乙醇提取物，发现对其蓝甲形成有抑制作用，且抑制百分率有剂量依赖性，其他提取物抑制不被用作比较是因为基本没有甲类产品形成。
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图 2 紫雪花不同根提取物对超氧自由基的清除作用
注: 呈现的结果标准偏差(n=3)
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1.4羟基自由基清除试验
紫雪花提取物对过氧化氢的清除能力是可以确定的。各种提取物对过氧化氢的清除能力如下(图3)。表明，乙醇提取物表现出最高的清除活性，包括对DPPH自由基和超氧阴离子的清除作用，其他提取物的活动并没有达到我们预期的标准。提取物的活性呈浓度依赖性。在最高浓度均为5 mg/ml时各种提取物的清除活性为乙醇提取物(86.68)%＞正己烷提取物(45.18%)>氯仿提取物(21.39%)。
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图 3 紫雪花不同根提取物对羟基自由基的清除作用
注: 呈现的结果标准偏差(n=3)
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2讨论
2.1切除伤口愈合
伤口愈合是一个复杂的现象，涉及一些良好的建设过程。这些过程包括实质细胞的再生，薄壁组织和结缔组织细胞的增殖。进一步的处理，包括细胞外基质蛋白的合成，结缔组织胶原化，薄壁组织成分胶原化和伤口强度采集重构。在这项研究中，切除创面模型用于建立了紫雪花的乙醇、氯仿、正己烷提取物的愈合潜力。从结果来看，很明显，乙醇和正己烷提取物具有一定的潜在的治疗作用。由于胶原蛋白的合成，它通过增强上皮化，表现出显著的伤口闭合效果。一些研究已经表明，化学成分如黄酮类、生物碱、皂甙、鞣质是促进伤口愈合的(Tuschiya et al., 1996; Mukherjee, 2002; Madhura et al., 2002; Ansel, 2006)。因此，该研究表明，乙醇和正己烷提取物具有伤口愈合性能可归因于化学成分如黄酮类、生物碱、皂甙、鞣质的单独或联合作用。从实验的结果来看，很明显，乙醇提取物相较于正己烷提取物和Burnol(一种标准的商业伤口愈合剂)有较好的伤口愈合能力。氯仿提取物是无效的伤口愈合剂。生物化学分析表明，小鼠的所有功能均正常，后伤口愈合，这表明提取物在局部应用时是无毒的，且它被证实不会干扰正常的身体功能。在未经处理的小鼠和用氯仿提取物治疗的小鼠的伤口感染的结果中，在伤口感染的白细胞计数上有显著性差异。乙醇提取物能显著降低感染，与正己烷提取物相比，紫雪花的乙醇提取物具有较好的伤口闭合效果，甚至作为一个更好的治疗选择可以替代商业伤口愈合剂如Burnol(盐酸氨吖啶, 溴化十六烷基三甲铵IP)。
有大量证据表明，活性氧产品的增加，脂质过氧化和无效清除，在皮肤病变和成纤维细胞的增殖调节中具有作用(Murrel et al., 1990)。皮肤创伤在总体的抗氧化中有一定抑制作用，使它更容易受到氧自由基的吸引(Shukla et al., 1997)。所有这些研究结果表明，在伤口愈合中，抗氧化剂可能发挥重要的作用。
2.2 DPPH自由基清除能力
DPPH抗氧化检测法是基于一个稳定的DPPH自由基的能力，脱色抗氧化剂的存在。DPPH自由基含有奇数电子，负责吸光度为490 nm和深紫色光线的吸收(Luo et al., 2010)。使用自由基治疗人类疾病，包括心血管疾病和癌症(Sreejayan et al., 1996)。人们已经发现，半胱氨酸，谷胱甘肽，抗坏血酸，对copherol、黄酮类、鞣质、芳香胺(对苯二胺, 对氨基苯酚等)，通过供氢能力减少和漂白DPPH (Deighton et al., 2000)。我们假设，紫雪花乙醇提取物中的酚类化合物可能参与其增强抗氧化性或非根治性活性。
2.3超氧阴离子自由基清除能力
超氧阴离子自由基，是生成的自由基中活性氧活性最强一族的一种(Blois, 1958)。作为一种活性氧物种的前体，它是一种对细胞成分非常有害的物种(Garrat, 1964)。超氧自由基是体内产生的，导致可以通过歧化反应形成过氧化氢。此外，将超氧阴离子和过氧化氢转换为更多的活性物质，如羟基自由基，被认为是由超氧自由基造成的不利影响(Halliwell, 1991)。黄酮类化合物的光化学还原生成氧气，从而降低NBT，致使蓝甲的形成(Nakayama, 1994)，这表明在紫雪花的乙醇提取物的黄酮化合物是负责这样的反应。
2.4羟基自由基清除试验
通过芬顿反应，亚铁盐可以与过氧化氢和羟基自由基反应。我们需要的铁来自于铁池或含有蛋白质的血红素。过氧化氢本身不是很活泼，但有时对细胞有毒，因为它可能会在细胞中产生羟基自由基(Murrel et al., 1990)。因此，去除过氧化氢在细胞和食物系统中的抗氧化防御中是非常重要的。膳食多酚也能保护哺乳动物的和细菌的细胞，防止因过氧化氢诱导产生细胞毒性，尤其是化合物与orthodi 羟基酚醛结构的槲皮素，儿茶素，没食子酸酯、咖啡酸乙酯的调和作用(Shukla, 1997)。因此，紫雪花的乙醇提取物的酚类物质可能参与清除过氧化氢。
3材料与方法
3.1不同根提取物的制备
将紫雪花的根源收集起来，进行清洗、阴干，制成粉末。得到的100克粉末在室温条件下保存于干净的无菌瓶中，用于各种提取物。粉末材料是每72小时在索氏提取器中用石油醚、氯仿、乙醇和水提取出来的。将提取物在减压条件下蒸发，获得的固体质量和提取物的产量百分比率是2.32%，2.05%，4.57%和16.6%。
3.2植物化学物质的筛选
为了确定生物碱、苷、黄酮、鞣质、萜类、甾醇、皂甙、脂肪和糖类的存在，对不同根提取物执行初步植物化学成分研究(颜色反应) (Khandelwal, 2005)。
3.3动物与分组
所有的动物都被安置在标准实验室条件(温度(22±2)â, ƒ湿度45%±5%, 12小时白天, 12小时夜间的循环)，并提供标准实验室饮食。在研究机构伦理委员会批准，并按照制度伦理准则和药物的批准文号/ IEC / 217-11 / 2011的要求，照顾试验动物的前提下，开展试验。
选取性别不限，体重在30±5克的瑞士白化小鼠。10% w/v的所有提取物，制备在加入了0.1%丙二醇的生理盐水中。小鼠随机分为五组，每组五只小鼠，第1组为对照组(对照组)，第2组动物均采用了Burnol，一个商业的伤口愈合剂(成分: 盐酸氨吖啶, 溴化十六烷基三甲铵IP)，第3组动物局部使用10% w/v紫雪花根部的乙醇提取物，第4组动物局部使用10% w/v的氯仿提取物，第5组动物使用紫雪花根部正己烷提取物。
3.4伤口愈合模型
对麻醉大鼠胸背区离脊柱2毫米和1厘米的地方，制作印记，并使用直径为5毫米的圆形密封容器。有印记的地方的批复被完全切除，以获得一个面积为100平方毫米的伤口区域。用浸泡在生理盐水中的棉签擦拭伤口，实现内稳定。通过跟踪的原始伤口对第一周的伤口愈合的机制进行了研究。通过仔细观察、研究其物理状态和行为变化，对不同批次的小鼠创面愈合的全过程进行了深入的分析。创面愈合程度为1(伤口相应天数/伤口初始天数)*100%。
3.5生化分析
通过对小鼠的胸前孔径进行心脏穿刺，以获得小鼠的血液，然后用半自动分析仪雷杜1904C分析此血液(表3)。
3.6抗氧化活性分析
3.6.1 DPPH自由基的清除试验
植物提取物的抗氧化活性是在对稳定的DPPH自由基的清除作用的基础上进行评估(Bang et al., 2001)。将乙醇提取物(0.2~5 mg/mL)中加入到200 uL的DPPH中，后制备入装在96微滴的微孔板的甲醇溶液中。在37℃，孵育30 min后，在490 nm处采用ELISA微孔板读者测定各溶液的吸光度(Bio-Rad Laboratories Inc., CA; 模型550)。剩余DPPH量和相应的空白读数也被计算了。IC50值是需要清除50%DPPH自由基的浓度样品。DPPH自由基清除作用(%)=(A0-A1)/A0×100，其中A0为对照的吸光度，A1是提取液的吸光度。
3.6.2超氧自由基的清除试验
该检测方法是以紫雪花提取物通过清除核黄素–光–NBT系统产生的超氧阴离子自由基的抑制甲形成能力为依据的(Beauchamp et al., 1971)。各3 ml反应混合物含有50 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.6)，核黄素20 mg，和12 mm的EDTA，0.1 mg的NBT和1ml样品溶液。首先，通过照亮反应混合物与不同浓度的样品提取物(25~100mg/mL) 90秒。立即，光照后，测定吸光度为590 nm。整个反应组件被封装在一个内衬铝箔的盒子里。与反应混合物的相同的管被保存在黑暗中，并作为空白。使用下面的公式计算产生的超氧阴离子的抑制百分率：超氧阴离子自由基清除活性(%)=[A0-A1]/Ao×100，其中A0为对照的吸光度，A1是提取液的吸光度。
3.6.3羟自由基的清除能力
紫雪花的乙醇、氯仿、正己烷提取物的羟基自由基的清除作用，是根据Beauchamp et al.(1971)和Wang et al.(2008)所采用的方法进行稍作调整后进行测定的。反应混合物含有1/9 ml的硫酸亚铁，1 ml的样品溶液加入不同量的水形成不同浓度的溶液(0~10 mg/mL)，最后加入1 ml/8.8 mN的过氧化氢，然后将反应混合物在室温下孵育30 min。测量出吸光度为510 nm，紫雪花不同根提取物的清除能力按照下面的公式计算：羟基自由基的清除效果(%)=[(A0-A1)/A0]×100，其中A0为对照的吸光度，A1是提取液的吸光度。
3.7统计分析
结果表示为平均标准差。实验组之间的差异采用单因素方差分析检验比较，在p＜0.01时，被认为具有有统计学意义。
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